Živná média
Abychom mohli připravit čistý a dostatečně koncentrovaný preparát bakterií, je zapotřebí je řádně odebrat a tento vzorek kultivovat. Cílem kultivace je namnožení bakterií a separace izolovaných kultur, k čemuž značně napomůžeme vytvořením vhodných podmínek. Mezi tyto podmínky patří zejmená vhodná teplota, vlhko (zajišťuje živné médium) a dostatek živin (zajišťuje živné médium).
Živná média
Živné médium je roztok různých organických i anorganických látek, které slouží jako zdroj energie, minerálů a živin pro bakterie. Podle složení rozlišujeme média přirozená (brambor, mléko), umělá (nepřesně definované složení) a syntetická (přesně definované složení). Prakticky nejhodnotnější je rozdělení médií podle jejich možnosti kultivace bakterií a indikace určitých vlastností. Podle tohoto kritéria se média dělí na:
A. Univerzální - většina bakterií je schopna na takovém médiu růst
B. Selektivní - médium, které obsahuje selektivní složky, jež mají za účel potlačit růst určitých bakterií, a tak zvýhodnit růst jiných (Rappaport-Vassiliadisova půda)
C. Diagnostická - média obohacená o složku, která indikuje produkty metabolismu bakterií
D. Selektivně-diagnostická - kombinace předchozích dvou typů. Média zvýhodňují růst určitých bakterií a navíc indikují určité metabolické vlastnosti (MacConcay agar - potlačuje růst většiny G+ bakterií, indikuje utilizaci laktózy (koliformní bakterie))
E. Transportní - média určená pro transport vzorku do laboratoře. Jsou navržena tak, aby bakterie přežily, ale nemnožily se (Amiesovo médium).
Každé médium musí obsahovat zdroj uhlíku, dusíku, minerálů, musí mít specifické pH a musi být izotonické. Různá média jsou navíc obohacena o další složky. Všechny tyto fyzikální a chemické vlastnosti určují vlastnosti média a to, které bakterie na něm budou prosperovat (vizte výše).
Tekutá média
Příprava tekutých médií je ve své podstatě nejjednodušší variantou. Jednoduše rozpustíme určité látky v určitém objemu vody. Vodu volíme zpravdla u syntetických médií destilovanou, a to z důvodu přesně definovaného složení. V případě přírodních médií může být použita voda vodovodní, avšak dbáme na dodatečnou úpravu pH, případně, pokud máme již připravená, komerčně dostupná dehydrovaná média, se řídíme pokyny výrobce. Tekutá média se uchovávají ve zkumavkách, současně ve zkumavkách probíhá i kultivace.
Tekutá média se používájí k pomnožení bakterií. Bakterie přijímají živiny celým povrchem buňky. Množení bakterií se projeví zákalem média, případně až sedimentem bakterií na dně zkumavky.
Univerzálním tekutým pomnožovacím médiem je masopeptonový bujón (MPB), s následujícím složením:
Masový extrakt ............ 10 g
Pepton .......................... 10 g
NaCl ............................... 5 g
Voda .................. do 1000 ml
Ztužená média
Ztuženými médii se rozumí tekuté médium bez změny složení, které je navíc obohaceno látkou způsobující ztužení roztoku. Takovými bývá želatina (bílkovina) nebo agar (polysacharid). Želatina byla kdysi poněkud více užívána než nyní. Přechod z želatiny na agar je dán pravděpodobně diskomfortem při sterililizaci, neboť želatinu nelze pro její termolabilitu autoklávovat. Želatina ovšem nese proti agaru jednu podstatnou výhodu, a sice pouze v želatinou ztužených médiích lze sledovat schopnost některých bakterií (Moraxella bovis, Staphylococcus...) želatinu ztekucovat, což svědčí o produkci proteolytických enzymů. V agarových médiích ztekucení pochopitelně nenajdeme.
V případě použití želatiny je zapotřebí k roztoku přidat 10 - 14 % laboratorní želatiny o vysoké čistotě (v zimním období 10 - 12 %, v letním 12 - 14 %). (Káš, 1932, s. 27). V případě použití agaru se přidává 1,5 - 2 %. V obou případech se nechá tužící materiál v roztoku nabobtnat a poté se zahřívá až do úplného rozpuštění (v případě agaru až těsně před bodem varu vody).
Určitým mezistupněm mezi tekutými a pevnými médii jsou média polotuhá (semisolidní). Jedná se taktéž o ztužená média, nicméně obsahují pouze 0,5% agaru. Semisolidní média se používají pro vpichové kultury k sledování určitých fyziologických vlastností (pohyb, vztah ke kyslíku...).
V zásadě známe v mirkobiologické praxi dva typy agarů. Jedná se o agar utuhlý v kolmé poloze a agar utuhlý v šikmé poloze. V prvním případě se jedná o agar ve zkumavce (pro vpichové kultury) nebo v petriho misce (pro separaci a pomnožení bakterií), v druhém případě se jedná o agar výlučně ve zkumace (případě dle potřeby v obdobné vysoké nádobce) pro nátěrovou kulturu.
Bakterie kultivované na tuhých médiích přijímají živiny pouze částí buňky, která se dotýká média. Současně platí, že kultivace na agarových médiích je krátkodobější. Výhodou je sledování kolonií bakterií a pohodlí při práci s tuhým médiem. Na tuhých médiích rovněž můžeme docílit snadné separace jednotlivých bakterií a vytvoření izolovaných kolonií (z jediné buňky), kterou lze dále subkultivací vyšetřovat.
Příprava živných médií
Živných médií existuje celá řada a nejlepší variantou je koupě již připravených dehydrovaných směsí, které se pouze rozpustí ve vodě dle návodu. Živná média si také můžeme připravit sami, a to podle dostupných návodů.
Univerzálním médiem, v praxi často používaným, je masopeptonový agar (MPA), který vzniká z MPB přidáním 1,5 - 2 % agaru.
Přidáním 5 - 10 % ovčí nebo koňské krve do MPA (přidává se asepticky až po strilizaci MPA, teplota musí spadnout na 40°C), získáme masopeptonový krevní agar (MPKA), bez kterého by se mikroskopické laboratoře prakricky neobešly. Některé bakterie produkují toxiny (hemolyziny, streptolyzin), které mají schopnost podněcovat hemolýzu. Tuto poté můžeme sledovat na ktevním agaru. Rozeznáváme dva, respektive tři typy hemolýzy:
α hemolýza (částečná, viridace) - agar má v okolí růstu kolonie zelenou barvu, krevní barvivo je částečně rozloženo;
β hemolýza (úplná) - agar v okolí růstu kolonie je transparentní, krevní barvivo je úplně rozloženo;
γ-hemolýza (resp. žádná) - k hemolýze nedochází, krevní barvivo není rozloženo, agar barvu nemění.
Zahřejeme-li MPKA na 80°C (resp. při přípravě vlijeme krev do MPA dříve než při přípravě MPKA), připravíme čokoládový agar (název odvozen od barvy, nikoli od složení). Čokoládový agar se hodí pro kultivaci náročných bakterií, jelikož při lýze krvinek dojde k uvolnění růstových faktorů (NAD+, hemin). Na tomto agaru však z výše popsaných důvodů nelze sledovat hemolýza.
Uchovávání médií
Živná média nejsou trvalá a neměla by se tedy připravovat do velkých zásob. Připravená média (zvlášťe pevná) nelze použít ihned po starilizaci, neboť jsou vlhká a nebylo by možné docílit postupného vyředění bakterií. Z toho důvodu se nechávají média odležet (během této doby se také mohou projevit případné kontaminace). Média se uchovávají v lednici buď ve větších nádobách (Erlenmayerovy baňky) uzavřených vatovou zátkou, nebo již přerozdělená ve finálních nádobách, ve kterých dochází k inokulaci (zkumavky uzavřené vatovou zátkou, petriho misky...).
Zdroj: KÁŠ, Václav. 1932. Mikrobiologické praktikum. Mikrobiologický průzkum půdy a chlévské mrvy. Ministerstvo zemědělství republiky Československé.