Ze světa nejmenších rozměrů

O odběru vzorku jsem již hovořil, nyní si řekneme něco o fixaci vzorku. Pakliže nejsme schopni vzorek zpracovat v určitém intervalu, který je definován dobou, po kterou zůstane vzorek po odebrání stálý, je nutno bezprostředně po odběru přistoupit k fixaci vzorku. Jedná se o opatření, kterým zabraňujeme autolýze. V některých oborech (histologie) musíme přistoupit k fixaci za každých okolností, jelikož tkáně autolyzují velice rychle po odebrání. Stejně tak budeme-li přistupovat k nekropsii, je nutné provést odběr co nejdříve po smrti organismu a ihned poté vzorek fixovat. K fixáži také musíme přistoupit, chceme-li ze vzorku vyrobit trvalý preparát.

Mech. Vlevo čerstvý preparát, vpravo částečně autolytický

Metody fixace se dají základně rozdělit do dvou kategorií:

A. Fyzikální fixace

1. Fixace teplem: organismus fixujeme zahřátím, během kterého denaturují proteiny. Působí změny tvaru a degradace buněk, hodí se pouze pro fixaci prokaryotních organismů.
2. Fixace chladem: zmrazení na velmi nízkou teplotu pomocí tekutého dusíku, zamezí rozkladným procesům. Použití pouze pro speciální metody zpracování.

B. Chemická fixace

Chemickou fixaci je myšleno vložení vzorku do foxačního roztoku. Objem vzorku by neměl přesahovat 1 cm² (prosycení vzorku činidlem) a objem fixačního roztoku by měl být 20 - 50 x větší než objem vzorku.

1. Methanol, ethanol: rozpouštějí lipidy, avšak způsobují křehnutí tkání a degradaci rostlinných pletiv (zejména extrahují chlorofyl). Používají se pro fixaci krevních nátěrů. Je možné použití ethanolu s přídavkem 2% benzenu.
2. Formaldehyd: výborné fixační činidlo, vzorky fixuje a nezpůsobuje příliš jejich degradaci. Používá se ve 4 - 10% roztok, obvykle však kolem 5%.
3. Anorganické soli: zejména chlorid rtuťnatý a dichroman draselný se používají ve fixačních směsích. Samy o sobě nemají výrazný účinek. Jejich nevýhodou je nedostupnost kvůli vysoké toxicitě.
4. Organické kyseliny: ledová kyselina octová, kyselina pikrová. Opět se využívají ve fixačních tekutinách, kyseliny velmi dobře pronikají do tkání a pletiv a zvyšují fixační účinek jiných činidel, avšak samy o sobě nemají příliš dobrý účinek.

Fixační směsi

1. Boulinova fixační tekutia:
   • kyselina pikrová .............. 150 ml
   • formaldehyd 40% ........... 50 ml
   • ledová kyselina octová ... 10 ml
2. FPA
   • ethanol 50% ............... 90 ml
   • kyselina propiniová .... 5 ml
   • formaldehyd 40% ....... 5 ml
3. FAA
   • ethanol 50 % .................. 90 ml
   • formaldehyd 40% ........... 5 ml
   • ledová kyselina octová ... 5 ml
4. Němcova fixační tekutina:
   • oxid chromový 1% ........... 25 ml
   • dichroman draselný 3% .... 25 ml
   • formaldehyd 40% .............. 4 ml
5. Navašinova fixační tekutina
   • oxid chromový 1% ........... 15 ml
   • ledová kyselina octová ..... 1,5 ml
   • formaldehyd 40% .............. 4 ml

Jakou fixační tekutinu zvolit

Volbu fixační tekutiny musíme přizpůsobit následnému zpracování vzorku a charakteru zorku. Do jisté míry je univerzální fixační tekutina vodný roztok formaldehydu. Pro histologii se používají Boulinova tekutina, Zenkerova tekutina, FAA nebo FPA, naopak pro cytologii (chceme-li pozorovat buňku a její detaily) se spíše hodí Němcova nebo Navašinova fixační tekutina.

Jak dlouho fixovat

Doba fixace je přímo úměrná velikosti objektu a použitému činidlu. Potřebujeme-li zafixovat nátěr buněk na podložním skle (krevní nátěr), postačí několikaminutová fixace, budeme-li fixovat velké objekty, je zapotřebí vzorek v tekutině ponechat několik hodin. Důležitější údaj je však pro nás doba, po kterou můžeme maximálně vzorek ve fixačním činidlu ponechat. Zpravidla tato doba nesmí přesáhnout 48 hodin u běžných fixačních tekutin, při použití samotného alkoholu 24 hodin. Naopak v případě vodného roztoku formaldehydu je tato doba neomezená (po čase však dojde k blednutní tkání).

Vypírání fixáže

Před následným zpracováním vzorku, který byl fixován je nutné fixační tekutiny ze vzorku vyprat. Vypíráme ve vodě. Doba vypírání je opět přímo úměrná velikosti vzorku.